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蜂斗菜总内酯造备及抗脑缺血药效学钻研可编纂

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  硕士学位论文蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 专业名称:生药学 研究生: 指点教员:郭斑斓传授 李润平副传授 培育单元: 第二军医大学药学院 申请学位: 科学学位 答辩日期:二。一二年六月九独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我小我正在导师指点下进行的研究 做。除了文中出格加以标注和称谢的处所外,论文中不包含其他人曾经 颁发或撰写过的研究。取我一同工做的同志对本研究所做的 任何贡 献均已正在论文中做了明白的申明并暗示谢意。本人承担本声明的 法令责 签字日期:功仨年月日学位论文做者签名:差蔷 学位论文利用授权书声明 本人完全领会第二军医大学相关保留、利用学位论文的,有 保留并向国度相关部分或机构送交论文的复印件和磁盘,答应论文被查 阅和借阅。本人授权第二军医大学能够将学位论文的全数或部门 内容编 入相关数据库进行检索,能够采用影印、缩印或扫描等复制手段 保留、 汇编学位论文。保密的学位论文正在解密后合用本授权书 学位论文做者签名:差荔 签字日期:签字日期: .目次中文摘要…. 缩略语申明..媒介…… 第一章蜂斗菜总内醑制备工艺的研究?…. 一.仪器和试剂?.. 一仪器?… 二药材?… 三试剂?…. 四对照品.. 二.毛裂蜂斗菜根茎总内酯的含量测定.. 一色谱前提?. 二溶液的配制?..三线性关系的调查?.. 四细密度调查?.. 五不变性调查?.. 七最低检测限?..八定量限.. 九毛裂蜂斗菜根茎总内酯的图谱?.. 三.蜂斗菜总内酯提取工艺研究.. 一药材的判定取前处置.. 二药材提取方式的调查.. 三渗漉法提取工艺的优化?.. 四提取工艺的验证?.. 五结论?.四、蜂斗菜总内酯纯化工艺研究.. 一大孔树脂的前处置?… 二型树脂用于纯化的机能调查.. 三的纯化?… 五、的含量测定?.. 一色谱前提?.. 二溶液的配制?.. 三线性关系的调查?.. 四细密度调查?.. 五不变性调查?.. 六加样同收尝试..七最低检测限一. 八定量限?…. 九的图谱?… 六、结论?.. 第二章腔抗脑缺血的药效学及机制切磋?.一. 一、蜂斗菜内酯类化合物对缺氧复氧致细胞毁伤的感化.. 二、对线栓法致大鼠局灶性脑缺血的医治感化?一. 三、对缺氧.复氧致海马神经元毁伤的感化及机制?… 第三章忆.初步急性毒性尝试?…. 第四章研究总结?.. 第五章文献综述?.. 一、蜂斗菜属动物分类概况?。. 一蜂斗菜属动物简介?.. 二国内个种分种检索表?.. 二、蜂斗菜属动物化学成分、药理感化和临床使用?.. 一化学成分?。.. 二药理感化?.. 三临床使用?一. 三、脑缺血神经元的研究进展?.. 一神经元毁伤的机制研究?一. 二医治缺血性脑卒中药物的新进展一. 三.取缺血性脑毁伤的研究进展?一. 参考文献… 称谢?…蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 中文摘要 .是菊科蜂斗菜属动物,普遍分布于西南、西北地域,其根茎平易近间用于解毒祛瘀,外敷治跌打毁伤、骨折 中国西北地域做为款冬花的替代品用于止咳、平喘。研究布景:蜂斗菜属动物欧蜂斗菜 做为动物药,正在欧洲曾经 有几百年的使用汗青。其根茎的二氧化碳提取物用于医治偏头疼, 泌尿生殖道痉挛, 哮喘,过敏性鼻炎等。倍半萜类化合物被认为是其次要无效成分, 现代药理研究表白, 蜂斗菜素和硫蜂斗菜素.等倍半萜类化合物具有抗炎,抗组胺, 抗氧化,白三烯合成,降低细胞内钙离子浓度的感化,从而达 效。倍半萜内酯类化合物,初步的体外药理尝试表白,这类化合物有具较强的抗氧化 活性,抗炎感化,可减轻神经毒性,具神经细胞感化。为了开 物资本,本课题组正在前期对其同属动物毛裂蜂斗菜化学成分进行了较为系统性的研究,从毛裂蜂斗菜根茎平分离得 到倍半萜内酯类化合. 物蜂斗菜内酯、蜂斗菜内酯以及蜂斗菜内酯 菜内酯’?,蜂斗菜内酯,蜂斗菜内酯个倍半萜类新化合物。本论文做为延续 性工做, 着沉对毛裂蜂斗菜内酯类无效成分的制备工艺及抗脑缺血的药 效学进行研究,旨正在为 毛裂蜂斗菜资本的开辟操纵以及毛裂蜂斗菜总内酯的新药研发 奠基根本。 研究目标:通过对毛裂蜂斗菜中蜂斗菜总内酯的制备工艺及抗脑 的开辟操纵以及新药的研发奠基根本。研究方式和成果: 、采用方式,成立毛裂蜂斗菜根茎的内酯类无效成分的含量测定 方式并 对并对毛裂蜂斗菜根茎的内酯类无效部位进行制备工艺研究,确 定了最佳工艺线。 本工艺总内酯正在纯化过程的平均转移率为.%,产物平均纯度 、蜂斗菜内酯.、、、、对缺氧.复氧致细胞毁伤的感化研究。采用缺氧.复氧致细胞毁伤的细胞模子来筛选蜂斗菜 内酯.、、 、、蜂斗菜总内酯的生物活性。通过检测蜂斗菜内酯一、、、、 预处置后对细胞缺氧.复氧毁伤后的细胞存活率和乳酸脱氢酶的 细胞的感化。采用法检测蜂斗菜内酯.、、、、别离为./、./、./、/、/、/、/、氏.,取模子组比力。阳性药银杏叶 片、依达拉奉也能无效改善大鼠的行为学 缺陷、降低脑坏死百分率尸.,取模子组比力。取阳性药银杏叶片、 比力,各剂量/、/、/组对大鼠行为学及脑坏死百分率均无显著性差别胗.。故 /对线栓法惹起的大鼠局灶性脑缺血再灌注毁伤有较着的医治感化,能改 为学缺陷,降低脑坏 死百分率。 、对缺氧一复氧致大鼠海马神经元细胞毁伤的感化。采用原 代大鼠 海马神经元细胞缺氧一复氧模子,模仿缺血.再灌注对细胞形成 的毁伤,通过采用 .染色法、法和卵白质印迹法检测细胞存活率、凋亡率和凋亡相 白一和的表达来察看蜂斗菜总内酯对缺氧.复氧致大鼠海马神经元细胞毁伤 的感化。成果显示,模子组取一般组比力,缺氧处置后细胞存 活率下降至.% .,细胞调亡率上升至.%.;蜂斗菜总内酯最大剂量给药组 /取模子组比力,给药组的细胞存活率上升至.%尸.,细胞调蜂斗 菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 亡率降低至.%.。别的,一般对照组取模子对照组比力,模子组细 .卵白表达程度上升,两组间差别均有统计学意义.;各个剂量给药组/、/、/取模子组比力,给药组的细胞卵白表 达程度下降,.卵白表达程度上升。给药各个剂量组取模子组间的 差别均有统计 学意义尸.,而且有必然的量效关系。表白蜂斗菜总内酯各个剂量 /、/能分歧程度地原代大鼠海马神经元形态,提高细胞增殖率,降低细胞凋亡率,并能下调促调亡卵白和上调抑调亡卵白., 降低缺氧 惹起的细胞调亡率,达到神经元感化。 、对缺氧.复氧致大鼠海马神经元细胞毁伤的感化机制摸索。 采用 免疫荧光法和卵白印迹法检测.信号通中、.、.、、、? 卵白表达程度及.相关通和中、?、、.的蛋 白表达程度来察看对神经元细胞的感化机制。尝试成果显示: 缺氧处置 后能上调.信号通中、.、.、、.卵白的表达,下调 卵白的表达,并能激活.通的核;各剂量组/、/、’ /能下调、.、.、、.卵白的表达,上调.卵白的 表达,并能.通的核。表白缺氧处置能激活.通, /、/、/通过.通的激活,达到神经元细. 胞感化,且有必然的量效关系。别的,模子组取一般组比力,.相关 通 和中、.、、?的卵白表达程度上升;各剂量组’。’ /、/、/能下调、?、、?卵白的表达, 且呈量效关系。表白缺氧处置能激活?通及其相关通和, 通过其激活,海马神经元细胞。 、初步急性毒性尝试成果表白,小鼠灌胃给药的无毒剂量为 .相当取大鼠无效剂量的倍,对折量值为./。 结论:通过蜂斗菜总内酯制备工艺获得的,其总内酯含量为.%,平 均转移率为.%。本工艺合用于从提取液中纯化,具有不变、快速、 成品 得率高及转移率高的长处。对线栓法惹起的大鼠局灶性脑缺血再 灌注毁伤有 较着的医治感化,并对缺氧一复氧致神经元细胞毁伤有必然 感化,其感化机制取 .通相关。 环节词:毛裂蜂斗菜,蜂斗菜总内酯,脑缺血,.信号通,机制第 二军医大学硕士学位论文 ..第二军医大学硕士学位论文缩略语申明 ..蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究.土上 缺血性脑卒中是一种常见急症,其率高、率高、复发率均较高,严沉危 害人体健康,给家庭和社会带来沉沉承担。跟着生齿老龄化,脑卒 中发病率呈上升趋 势,此中缺血性脑卒中约占%。缺血性脑卒中是因为脑动脉的血流 短暂或持久削减 惹起,大部门由脑动脉或血栓构成所致,钙超载、基反映、梗 死灶四周除极化、 炎症和凋亡是形成缺血性脑损害的核心环节【。药物性脑旨 正在用药物阻断缺血 导致的神经元坏死、耽误耐受性缺血时间和医治时间窗,加强神 经元能力,逆转 半暗带,削减梗死体积,推进神经功能恢复。脑药是目前神经 学界研究的热点, 各类药物处于分歧研究阶段,但目前还没有一种药物取得的切当疗效【】。 神经剂意正在减轻微胞损害和救护脑组织,缺血病理级联反映 的每个步调都是‘ 医治干涉的潜正在靶点,目前有浩繁神经剂已进入期无效性试 验,但成果均不愿 定,它们包罗钙通道拮抗剂,受体拮抗剂、?,基清 除剂和、,冲动剂,钠通道拮抗剂 ,镁剂,糖化乙基位点拮抗剂和引。正在缺血性脑血 管病中,仅有溶栓剂正在临床表白有疗效,而各类神经医治只 正在动物有切当疗效, 而正在人类无效,但它耽误溶栓医治的时间窗。其次要缘由是缺血 病理反映复杂,而单 一神经剂不成能涵盖所有的缺血毁伤机制,因而难以起到最 佳及必定的神经 感化。选用抱负的神经剂应具有多种感化机制,血脑樊篱透 过率高、平安性高、 副感化少、无效时间窗范畴广,并可取溶栓药物或抗凝剂及抗血 小板堆积剂等合用【】。 中药是医学的伟大宝库,对于脑缺血神经元,西医药堆集了 丰硕的临床经验,也 有很多精辟的理论看法。中药的构成成分多样,因此大多有多方 面的功能,更易于达 到从多条路子干涉脑缺血的病理反映,目前已有大量的临床取实 验证明西医药能无效 地医治脑缺血神经元损害,越来越多的学者体味到从西医药范畴 寻找神经元思 取药源是一条主要路子。 菊科蜂斗菜属动物次要分布于欧洲北部和地域。倍半萜 类化合物和三萜 类化合物是其次要特征性成分【。 。现代药理研究,蜂斗素和硫蜂斗素 .等倍半萜类化合物具有降低细胞内浓度,抗组胺、白三烯合 菜进行了系统的化学成分研究及初步的药理尝试切磋,因而本研究是正在前期尝试的基 础之上,对蜂斗菜总内酯抗脑缺血的药效学进行研究,研究中所 用蜂斗菜总内酯为课第二军医大学硕士学位论丈 题组自提,经?法测定,蜂斗菜总内酯中内酯.、、、的总含量为 .%,内酯一、、、的化学布局见图,的图谱见图。 .内酯、.内酯、.内酯、内酯目前对蜂斗菜的活性成分及对脑缺血的医治感化的研究报道甚 少,本课题组近几 年一曲努力于这方面的研究,本课题正在前人化学研究根本上,进 一步切磋其生物活性 及药效学机制,为当前对蜂斗菜新药的研发供给科学根据。蜂斗 菜.内酯制备及抗脑缺血药效学研究 第一章蜂斗菜总内酯制备工艺的研究 仪器和试剂 一仪器 安捷伦型高效液相色谱仪,包罗泵,检测器,安捷伦从动 气相色谱仪,包罗氢火焰离子化检测器,惠普公司产物。二药材 产地:四川成都; 采集期:年月; 加工:除去土壤,切成.厚,晒干; 含量:总内酯的含量为.%。 三试剂 %乙醇,药用,上海醇江试剂公司产物; 甲醇,色谱纯,杰帝贝柯化工产物无限公司产物; 乙腈,色谱纯,杰帝贝柯化工产物无限公司产物; 四氢呋喃,色谱纯,杰帝贝柯化工产物无限公司产物: 水,杭州娃哈哈集团无限公司产物; 型大孔树脂,南开大学研制,天津正天成手艺无限公司出产。 四对照品 内酯 便宜,纯度为%; 内酯 便宜,纯度为.%; 内酯 ,便宜,纯度为%; 内酯 ,便宜,纯度为.%。第二军医大学硕士学位论文 二.毛裂蜂斗菜根茎总内酯的含量测定 一色谱前提 色谱柱:迪马岬,.;流动相:四氢呋喃.乙腈一水::,恒 速洗脱。流速:./;检测波长:一,?,柱温: ;色谱阐发时间:。 正在此前提下检测化合物正在药材中能达到完全分手。 图.药材图 .内酯、.内酯、.内酯、内酯 溶液的配制 、对照品溶液的配制 细密称取蜂斗菜内酯.、蜂斗菜内酯.、蜂斗菜内酯一. 和蜂斗菜内酯..置于容量瓶顶用甲醇消融和定容。.滤膜过滤, 做为对照品溶液备用。 、供试品溶液的配制 根茎破坏后,细密称取.,置锥形瓶中,插手甲醇,密闭超声提 取分钟,上清液.滤膜过滤,残渣以上述方式再提取一次,归并滤 压浓缩,以甲醇定容至备用。蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 三线性关系的调查 别离称取蜂斗菜内酯、蜂斗菜内酯.、蜂斗菜内酯一、蜂斗菜内 ,甲醇消融,.滤膜过滤,各进样次,确定各化合物的保留时间,数据见表.: 表.保留时间 图.夹杂对照品图 .内酯、.内酯、.内酯、内酯 细密吸收上述对照品溶液,.别离置于容量瓶中,甲醇定容。别离进样,反复三次,取平均值, 成果见 表.浓度及峰面积第二军医大学硕士学位论文以对照品浓度对峰面积进行线性回归,得四个组分的回归方程 表.四种内酯的回归方程回归系数 线性范畴 四细密度调查取统一对照品溶液反复进样次,每次,对照品中蜂斗菜内酯,,, 峰面积的%见表.: 表.细密度尝试数据 号浓度 峰面积 号浓度峰面积 ..蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究五不变性调查 取对照品溶液每隔进样一次,每次.,共进样次,成果蜂斗菜内酯, ,,峰面积的%值见表.: 表.不变性数据 六加样收受接管尝试 细密称取样品份,别离细密插手.、.、.的对照品溶液,按照供 试品项下的方式制备供试液,进样.,别离计较蜂斗菜内酯,,, ?均收受接管率,成果见表.:表.加样同收尝试数据 ..第二军医大学硕士学位论文最低检测限 图.毛裂蜂斗菜根苯最低检测限.内酯、.内酯、.内酯、内酯 内酯浓度:./,内酯浓度:./,内酯浓度: ./,内酯浓度:./。 八定量限 图.毛裂蜂斗菜根茎定量限.内酯、.内酯、内酯、内酯 内酯浓度:./,内酯浓度:./,内酯浓度:./, 内酯浓度:./。 ..蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 九毛裂蜂斗菜根茎总内酯的图谱 通过尺度品回归方程计较获得药材中蜂斗菜内酯、蜂斗菜内酯、蜂斗菜内酯 、蜂斗菜内酯含量别离为.%。 研究小结:本研究成立了毛裂蜂斗菜中内酯类化合物的测定方式, 方式简 便靠得住。不只为节制毛裂蜂斗菜的内正在质量供给了科学根据,而 且为当前将其开辟成 现代中药奠基了根本。 三.蜂斗菜总内酯提取工艺研究 一药材的判定取前处置 、药材的判定 的根茎。标本存放于第二军医大学药学院生药学教研室,并于药圃中栽培。 采集毛裂蜂斗菜根茎,抖出大块土壤后,以水冲尽泥沙。将新颖根茎切制成厚约 .的纵切片,晒干。 二药材提取方式的调查总内酯是倍半萜类化合物,正在醇水系统中消融性较高,乙醇是常 用的溶媒,其安 全性高,适宜工艺化出产,且价钱廉价,故选用%乙醇做为溶媒,对 渗漉法,浸渍 法,回流法种提取方式进行调查,测定所得提取物总内酯的含量, 以确定提取方式。第二军医大学硕士学位论文 将毛裂蜂斗菜干燥。取,磨碎,用溶媒浸渍后,以每小时速度渗漉,收集的渗漉液,减压浓缩至干,用甲醇定容至,待测。 、浸渍法 将毛裂蜂斗菜干燥。取,磨碎,用溶媒浸渍后,不时摇动室温, 滤过,收集滤液,共次,归并浸出液,减压浓缩至干,用甲醇定容至, 、回流法将毛裂蜂斗菜干燥。取,磨碎,用的溶媒回流提取次,每次保 持微沸,冷却后,过滤,归并过滤液,减压浓缩至干,用甲醇定容至, 、尝试成果表.三种提取方式对毛裂蜂斗菜中总内酯提取率的影响 成果显示:三种提取方式中,渗漉法提取效率较高,且具有耗能低 的长处。故选 用渗漉法做为毛裂蜂斗菜总内酯的提取方式。但影响渗漉法提取 效率的要素较多,为 获得最佳提取工艺,我们对渗漉法提取的工艺进行进一步优化。 三渗漉法提取工艺的优化。 正在对提取方式初步选定后,次要调查提取效率影响较大的四项因 素,即:乙醇 浓度%;:乙醇用量倍;:渗漉速度/;:浸泡时间。每个要素各取 个程度见表.。将毛裂蜂斗菜药材干燥小时,至含水量%以下。 ?第二军医大学硕士学位论文成果表白渗漉法提取中,调查的个要素对提取结果的影响程度依 。表白乙醇浓度影响最大,其次为渗漉速度,再次是浸泡时间,而正在调查范 围内乙醇用量影响最小。因而,各要素的最佳程度组合为。即: 干燥毛裂 蜂斗菜药材以%乙醇做提取溶媒,先以倍量溶媒浸湿,再收集倍量 溶媒 四提取工艺的验证将毛裂蜂斗菜药材干燥小时,至含水量%以下,破坏。取,以 %乙醇浸湿后,再用%乙醇渗漉,渗漉速度为 /,收集 渗漉液,减压浓缩并定容,共次。法测定其总内酯含量。成果见表 的提取率提取率% 批次含量/ 平均成果显示,本提取工艺的转移率为.%,提取较为完全。 五结论 的最佳提取工艺为:药材破坏,用%乙醇做提取溶媒,先以倍量溶 媒浸湿,再收集倍量溶媒渗漉,渗漉速度为./提取。 本工艺总内酯的提取率跨越%,提取较为完全。 四、蜂斗菜总内酯纯化工艺研究 %乙醇提取液的次要成分为倍半萜内酯类化合物蜂斗素、异蜂斗 油烯、水芹烯、丁喷鼻烯、瓦伦烯等,要纯化,必需将生物碱、挥发油类 成分做为杂质去除。按照大孔树脂的吸附特征,型非极性树脂能 够满脚工艺 要求,并合用于工业化出产。因而,我们选择型树脂进行制备。 型大孔树脂由苯乙烯、二乙烯苯及致孔剂悬浮聚合,最初去致孔 新树脂含有杂质,必需前处置,不然,产物中将会残留甲苯、二乙烯苯等物质,正在一蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 定程度上影响平安性。我们根据厂家供给的利用仿单,对其进 行了前处置。 鉴于未见有利用型树脂制备的文献报道,我们研究了其纯化 的各类机能,优化并确定了纯化工艺。 一大孔树脂的前处置 、树脂的处置及检测 无机溶剂处置 用倍树脂床体积的%乙醇浸泡后,回流提取,滤除乙醇后拆 柱,插手新颖的%乙醇,以/的流速通过树脂层,持续洗脱至洗出液 插手 倍量水不混浊,再以蒸馏水洗脱,流速为 处置。酸、碱处置 酸处置:插手的%液浸泡后,以/的流速通过树脂层,再用蒸馏水以同样速度洗至为中性。 碱处置:插手的%液浸泡后,以/的流速通过树脂层,再 用蒸馏水以同样速度洗至为中性。 酸、碱处置反复次。 、无害物质的查抄及成果 因为型大孔树脂的出产过程中可能有甲苯、二甲苯、苯乙烯、二 乙烯苯等 杂质残留,故需检测处置后树脂的洗脱液和利用过程中的洗脱液 中上述物质的残留。 型大孔树脂经%乙醇处置,再经酸、碱处置后的乙醇洗脱液中均未 检出 苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯以及二乙烯苯。 、结论 新购型大孔树脂中会含有少量无害物质的残留物,必需进行前处 型大孔树脂经乙醇处置后,再经酸、碱频频处置,可以或许无效去除苯、甲苯、二甲苯、 苯乙烯和二乙烯苯。采用途理后型大孔树脂纯化总内酯,产品中 检测不出上述 无害物质。本尝试采用的处置方式可以或许无效去除残留物。处置后 的型大孔树脂 可用于纯化总内酯,平安性高。以总内酯的含量为目标,采用法进 行测定,具体操做方式及色谱前提拜见 提取工艺项下。 检测方式:法检测四个内酯类化合物,展开系统:石油醚.丙酮: 、尝试成果 型树脂的吸附机能及其影响要素 吸附容量 将总内酯含量为./的供试样品液通入拆有体积为树脂 的色谱柱中,流速为. /,测定流出液中总内酯的含量,曲至树脂吸附饱和为止。 成果见表.。蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 的样品液。当处置到. 成果显示,树脂达到饱和形态时可处置约. 时,流出液中总内酯的含量为./,此时,通过可查抄出总内酯,吸 /。故确定纯化时的加样量为.样品液浓度对吸附的影响 别离将总内酯含量为.、.、.、.、.、./的 供试样品液通入拆有体积为树脂的色谱柱中,进行吸附尝试,流 式.中:为样品液浓度/,为树脂床干床后的溶液浓度/,为树脂分量,为样品液体积,为树脂床干床后的溶液体积, 为吸附量/。 经调查,湿树脂拆柱后,树脂床干床后可得.的水,故起码上样量 确定为 。浓度为.、. /的供试样品液上样后,流出液中总内酯的 含量均跨越./,判断为超载,不予调查。成果见表.。 表.样品液浓度取树脂吸附率的关系第二军医大学硕士学位论文 成果显示,样品液浓度对树脂的吸附机能具有必然的影响,但影 响不大。当样品 液浓度正在.~. /范畴内时,该型树脂对总内酯的吸附量连结不变。 流速对吸附的影响 将总内酯含量为./的供试样品液以分歧流速通入拆有体积为 树脂的色谱柱中,当流出液浓度达到或跨越./时遏制加样,调查 速对树脂吸附量的影响,成果见表.。表.流速取吸附量的关系 成果显示,正在较低流速时,树脂具有较大的吸附量,跟着流速的增 加,树脂吸附 型树脂的脱附机能考虑到药物的平安性及总内酯的理化性质,洗脱液选择乙醇一水 系统为佳。将总 内酯含量为./的供试样品液通入拆有体积为树脂的色 谱柱中,用蒸馏水及分歧浓度的乙醇梯度洗脱,流速为. /,薄层色谱法 定性查抄各部门洗脱液中化合物,以确定改换洗脱液。各部门洗 脱液减压干燥,计较 各洗脱液用量及总内酯的含量。成果见表.。 表.分歧浓度乙醇洗脱部位的物质分布蜂斗菜总内酯制备及抗脑 缺血药效学研究 按照上述成果,调整试验方案。将总内酯含量为. /的供试样品液 通入拆有体积为树脂的色谱柱中,用%醇、%醇、%乙醇、 %醇梯度洗脱,流速为. /,薄层色谱性查抄各部门洗脱液中 合物,以确定改换洗脱液。计较各洗脱液用量及分歧乙醇中的含量。成果见表.。 表.分歧浓度乙醇洗脱部位的物质分布 表.表白,蜂斗菜总内酯次要存正在于%乙醇洗脱部门,故确定蜂斗 酯的脱附方式为:采用的%乙醇洗脱后,用的%乙醇洗脱,再用的%醇洗脱,用的%乙醇洗脱,收集%醇洗脱部门。 树脂的、再生 利用周期 将四个化合物的总含量为./的供试样品液通入拆有体 积为树脂的色谱柱中,加样量为.,用%、%、%、%乙醇梯 度洗脱,流速为./,再以蒸馏水洗去树脂柱中的乙醇后进行下一 轮上样洗脱, 树脂轮回利用;每个轮回均取.湿树脂,调查树脂的累计吸附量对 其静态吸附效 果的影响,反复次,以新树脂的最大吸附量为%,计较各检测点的 吸附率,结 果见图.。成果显示,型树脂轮回利用,累计吸附量正在./时,对 总内酯仍具有较佳的吸附率为新树脂的%以上,合适,但到累 计吸附量达 到./,其吸附量下降到新树脂%以下,必需经再生后利用。故按上 累计吸附量对吸附结果的影响第二军医大学硕士学位论文..蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 图.累计吸附量对吸附结果的影响再生 将待再生的树脂用蒸馏水洗脱至无醇味,进行碱水的动态或静态 处置。 动态处置:间接正在树脂柱中通入的%液浸泡后,加 %液以/的流速通过树脂层,再用蒸馏水同样速度洗至中性。 静态处置:用的%液,浸泡时常搅拌后滤出,以蒸馏水洗 至为中性。 察看上述种方式处置后的树脂性状,并进行静态吸附尝试,调查 碱处置再生对 吸附率的影响,成果显示,种方式处置的树脂外不雅性状不异,均为 浅棕色,吸附率 别离为新树脂的.%、.%。表白树脂通过%液静态或动态处置再 生后,合用于的纯化。 进一步伐查再生次数对树脂吸附量的影响,连调查个再生轮回, 成果见图., 成果显示,树脂颠末次再生后,其静态吸附量下降为新树脂的%以 下,不宜再 生利用。 表.再生对吸附结果的影响再生次数 再生次数次图.再生对吸附结果的影响 三的纯化 因为过一次大孔树脂总内酯的含量只要%摆布,必需过第二次大 孔树脂提高总 内酯的含量。将总内酯含量为./的供试样品液,通入拆有体积 /。收集% 为树脂的色谱柱中,用分歧浓度的乙醇梯度洗脱,流速为. 乙醇浓度部位。将两根大孔树脂所得的%乙醇部位浓缩至至%乙醇 密度. /.温度后,通入拆有体积为树脂的色谱柱中,用用的 %,的%,的%,的%乙醇浓度进行梯度洗脱。收集% 乙醇浓度部位,浓缩测总内酯含量。三批样品总内酯含量别离 五、的含量测定一色谱前提 同第一章二一 二溶液的配制 同第一章二二 三线性关系的调查 同第一章二三蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 四细密度调查 同第一章二四 五不变性调查 同第一章二五 六加样收受接管尝试 细密称取的样品份,别离细密插手对照品溶液,按照供试品项下 表.加样同收尝试数据同收率% 实丈量中的量 七最低检测限同第一章二七 八定量限 同第一章二八 九的图谱 ..第二军医大学硕士学位论文 .内酯、.内酯、.内酯、牛内酯通过尺度品回归方程计较获得三批样品中蜂斗菜内酯、蜂斗菜内 蜂斗菜内酯、蜂斗菜内酯含量别离为.%、.%、.%。六、结论 药材%乙醇渗漉液经减压浓缩、过滤,滤液经大孔树脂吸附、洗脱, 可获得棕 本工艺合用于从提取液中纯化,具有不变、快速、成品得率高及转移率 高的长处:别的,本工艺除乙醇外,无须利用其它无机溶剂。第二 弟一早一、蜂斗菜内酯类 护感化 为菊科动物毛裂蜂斗菜根部%醇部位的提取物,其内酯、、、 总含量为.%。 .内酯、.内酯、.内酯、内酯第二军医大学硕士学位论文图.蜂斗菜内酯.、、、的化学布局图 一尝试目标: 采用细胞缺氧一复氧毁伤模子,检测毛裂蜂斗菜.内酯、内酯、内 内酯和对细胞缺氧一复氧毁伤后的存活力和乳酸脱氢酶的影响, 察看单体化合物内酯、内酯、内酯、内酯和对缺氧.复氧致细胞 毁伤的感化。 二尝试材料: 型厌氧培育系统美国 公司;细胞培育箱美国 公司型倒置相差显微镜公司;型酶标仪 .公司。培育液、无糖、胎牛血清、马血清均购自美国 公司;甲基偶氮唑盐.,逐个?,一、均购自碧云天:乳酸脱氢酶灏试盒为南京建成生物工程研究所 产物。受试样品:蜂斗菜内酯一、、和纯度为%、纯度为.%, 均为便宜蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效学研究 尝试方式: 、细胞培育. 细胞株购于中科院上海细胞研究所,培育于含%的马血清、%的胎 血清、%培育基中,正在,%培育箱内培育。细胞以.%的胰卵白酶消化,每.天传代一次。正在细胞对数发展期进行药物处置。 、缺氧.复氧方式 细胞共份,分为一般组份、模子组份和给药组份。各组均弃 去原培育液,用无糖洗两次。正在模子组内插手无糖 进行缺氧处置,取出后转至、%%,%的厌氧培育系统中培育 ,培育箱内继续培育 。给药组于缺氧处置前插手含药无糖为酯、 内酯、内酯、内酯和用无糖别离配成./、./、 ./、/、/、/、/、/的溶液,用无菌 滤膜过滤除菌后利用,先正在、%培育箱内培育,然后再进 行缺氧处置,其余处置同模子组。一般组不进行缺氧处置,其余处 理同模子组。 、细胞活性测定。丌法 取对数发展期细胞,以/孔接种于孔板,正在、%培育前提下 留宿,按尝试要求给以分歧的处置要素,每组个平行孔,处置终止 后每孔插手 溶液 /,孵育 后每孔插手二甲基亚砜,震动使蓝 ,参考波长 紫色结晶物甲臌充实消融,正在酶标仪测定波长 上测吸光度值,细胞存活率%处置组的值一空白对照值/对照组的 值一空白对照值%。 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可代谢,发生结晶状的深紫色甲 瓒结晶。 利用能够消融甲瓒结晶,通过酶标仪测定波利益的吸光度,其值 细胞数成反比,故法常用于细胞活性测定。、乳酸脱氢酶 ,的测定 取对数发展期细胞,以/孔接种于孔板,/孔,按试验分组要求, 进行分组并给以分歧的处置要素,尝试终止时每孔取细胞上清液, 严酷按照 测定试剂盒申明进行尝试操做,采用紫外分光光度仪啪测定样品 吸光度,第二军医大学硕士学位论文 并按试剂盒公式计较培育液中活力。 是胞浆标记酶,细胞膜受毁伤后被释出细胞外,因此是反映膜损 伤程度的 目标。能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸取,一二硝基苯肼反映 生成丙酮 酸二硝基苯腙,正在碱性溶液中呈现棕红色,通过比色测定获得酶 的活性。 四尝试成果: 、蜂斗菜内醑类化合物对缺氧预处置后细胞存活率的影响 用来察看蜂斗菜内酯.、、、、对缺氧预处置推进细 胞存活率的影响。检测成果显示,缺氧预处置能够使细胞存活率 下降,蜂斗菜 内酯.、、、、为最大浓度/时使细胞存活率别离由.:. %上升至..%、..%、..%、..%、.. %。由此能够申明,内酯、内酯、内酯、内酯和正在剂量范畴 ./内均能提高缺氧处置后细胞存活率,且有必然的量效关系。 表.蜂斗菜内酯.、、、、对细胞存活率的影响工士 注:.尸.?.尸.取模子组比力蜂斗菜总内酯制备及抗脑缺血药效 学研究 图.蜂斗菜内酯.、、、和对细胞存活率的影响、蜂斗菜内酯类化合物对缺氧预处置后细胞的活性的 影响 细胞上清液中含量能够反映细胞毁伤程度。尝试成果显示,模子 组取一般 组比力,缺氧处置后细胞上清液中含量由.几升高到.:. /;蜂斗菜内酯.、、、、为最大浓度/时能够使细胞 上清液中含量别离由.:.几降低至./、.. /、../、.几、../.。由此 能够申明,蜂斗菜内酯.、、、、正在剂量范畴/./内 能通过缺氧处置后细胞乳酸脱氢酶,降低细胞毁伤程

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